3. 结果与讨论
3.1. 通过 TEM 分析噬菌体病毒粒子的形态特征
噬菌体SentS01L和SentS01T的TEM显微照片如图1所示 。
图 1.噬菌体 SentS01L ( a ) 和 SentS01T ( b ) 的负染色 TEM 显微照片。
噬菌体的形态（图1）表明这两种噬菌体都表现出管病毒形态类型，并且被分类为有尾病毒纲。噬菌体 SentS01L 和 SentS01T 显示出完美的二十面体头部和长而灵活的不收缩的尾巴。
3.2. 通过 SDS-PAGE 分析获得噬菌体 Sents01l 和 Sents01t 病毒体的结构蛋白谱
SDS-PAGE 电泳结果（图 2）显示，两种噬菌体均具有跨广泛分子量范围的结构蛋白谱。
图 2. 噬菌体 SentS01L 和 SentS01T 的蛋白质以及分子量标记的电泳图（泳道 M）。
3.3. 结合裂解噬菌体混合物的可食用抗菌涂层（Ediphage）的制备和表征
以海藻酸钠为原料，通过离子型凝胶法制备可食性抗菌涂层。海藻酸盐是一种天然来源的多糖，具有有趣的特性，包括无毒、生物降解性和胶凝能力[ 31 ]。因此，选择它来配制可食用抗菌涂层。海藻酸钠已有效地用于可食用涂层和薄膜中以保护食品以及作为某些食品保存剂（抗氧化剂和抗菌剂）的载体[ 32 ]。此外，其他研究表明基于藻酸盐的基质适合噬菌体包涵体[ 33 ]。 在藻酸盐溶液中使用CaCO 3 ，因为其溶解性差，可以形成受控且均匀的凝胶。
该技术可以制备具有薄膜状外观、厚度和柔韧性的涂层，适合用作食品应用的抗菌涂层。该涂层是均匀半透明的，可在奶酪样品上形成一层细腻的薄膜（图 3 a,c），厚度为 0.03 mm ± 0.009（EdiPhage 涂层）和 0.03 mm ± 0.005（无噬菌体涂层）。20小时后，薄膜保持不变，表明噬菌体混合物的添加没有改变凝胶的三维结构（图3d）。
图 3. 通过离子型胶凝获得的海藻酸钙 EdiPhage 图像 ( a ) 以及喷洒 EdiPhage 制剂之前 ( b )、喷洒 EdiPhage 制剂后立即 ( c ) 以及喷洒 EdiPhage 制剂 20 小时后成熟奶酪样品的图像EdiPhage 制剂 ( d )。
由于噬菌体颗粒的可用性和/或活力可能会受到其在各种基质上的固定化的影响，因此评估了固定在 EdiPhage 涂层中的噬菌体病毒颗粒的活性。将它们整合到薄膜、涂层和水凝胶中的过程使它们暴露在压力条件下，包括搅拌、干燥和混合[ 34 ]。
具有肠沙门氏菌CCCD-S004的培养皿以及含有和不含有裂解噬菌体混合物的 Ediphage 涂层样品的图像 如图 4a、b 所示 。裂解区在图 4b中可见 ，表明噬菌体混合物的裂解活性在 EdiPhage 制剂聚合后得以维持。噬菌体病毒粒子被 EdiPhage 涂层的聚合海藻酸钙生物聚合基质包埋，使病毒粒子的结构和功能稳定性成为可能，同时保留其裂解活力。
图 4. 聚合 EdiPhage 涂层内截留的噬菌体颗粒的裂解活力评估结果。( a ) 不含噬菌体颗粒的 EdiPhage 基质，( b ) 以 MOI 1000 整合噬菌体混合物的生物活性 EdiPhage 涂层。
关于生物活性抗菌 EdiPhage 涂层的细胞毒性评估，结果表明，在 HaCaT 或 3T3 细胞系进行的测定中，24 小时后没有因与 EdiPhage 涂层接触而导致任何细胞死亡（图 5 ）。
图 5. 整合了裂解噬菌体颗粒混合物的抗菌 EdiPhage 涂层对 HaCaT 和 3T3 细胞谱系的细胞毒性分析。
使用 X 射线荧光光谱仪测定不含噬菌体混合物和整合噬菌体混合物的 EdiPhage 涂层的元素组成。最常见的物质是纤维素[(C 12 H 20 O 10 ) n ]、钠(Na)、氯(Cl)和钙(Ca)（图6）。海藻酸钠是可食用涂层的基础，是从海藻中提取的，在其提取和纯化过程中通常添加甲醛、0.2%HCl溶液和2%碳酸钠溶液[35 ]。因此，大量的纤维素、钠和氯很可能源自海藻酸钠。由于在离子凝胶化过程中添加了钙 (Ca)，因此也发现其浓度较高。磷 (P)、钾 (K) 和镁 (Mg) 是其他值得注意的元素，很可能源自噬菌体悬浮液。但这些物质不被认为是有害的。存在的其他元素，但浓度较低，可能源自用于获得 EdiPhage 涂层的原材料。这些元素可能是自然存在的，也可能是在产品合成过程中有意添加的，或者是由于在整个制造过程中与加工机械相互作用而意外引入的[ 36 ]。
图 6. 通过 EDXRF 获得的普通 EdiPhage 涂层和整合噬菌体混合物的抗菌生物活性 EdiPhage 涂层的元素分布。
图 7 显示了普通 EdiPhage 涂层、整合了噬菌体混合物的抗菌生物活性 EdiPhage 涂层以及 SM 缓冲液中的噬菌体混合物的 FTIR 光谱。
图 7. 普通 EdiPhage 涂层（蓝线）、整合噬菌体混合物的抗菌生物活性 EdiPhage 涂层（品红色线）以及 SM 缓冲液中的噬菌体混合物（绿线）的傅里叶变换红外 (FTIR) 光谱。
费尔南德斯等人。[ 37 ]，分析基于藻酸钠的聚合物，观察到3200至3600cm -1之间的宽带， 对应于藻酸盐聚合物链中存在的OH基团的伸长。Daemi 和 Barikan [ 38 ] 在 3000 至 3600 cm -1之间的波段也观察到了同样的情况 （图 7）。 在获得的光谱中，还可以观察到3500cm -1附近的宽带。费尔南德斯等人。[ 37 ]还在1414 cm -1 和1621 cm -1处观察到谱带，它们分别与-COO-基团的不对称和对称轴向变形相关，表明藻酸盐中存在羧酸基团。在研究的光谱中，在普通 EdiPhage 涂层（无噬菌体颗粒）中观察到在 1700 至 1100 cm -1之间的大约范围内更强烈的峰，特别是在 1745.58 和 1165.00 cm -1处的峰 （图 7）。也许 SM 缓冲液和 -COO- 基团产生的化合物之间可能存在某种相互作用。Helmiyati 和 Aprilliza [ 39 ] 在藻酸盐样品中观察到 2928 cm -1附近的峰，并表明这是由于 CH 2基团 的拉伸所致 。在普通EdiPhage涂层（无噬菌体颗粒）中观察到闭合峰（2926.01 cm -1 ）（图7）。在整合了噬菌体混合物的抗菌生物活性 EdiPhage 涂层中发现没有该峰（图 7），这可能表明 SM 缓冲液和藻酸盐产生的化合物之间存在某种相互作用，例如 CH-O 键合。由于与氧和氮相比其电负性非常差，碳不被认为是传统的氢键供体。然而，一些研究表明，即使是脂肪族碳原子也能够形成弱氢键，称为CH-O氢键[ 40 ]。
这些条带出现在 2964.59 和 2798.71 cm -1 （整合了噬菌体混合物的生物活性 EdiPhage 涂层）和 2964.59；2926.01 和 2854.65 cm -1处的那些 （纯 EdiPhage 涂层（无噬菌体颗粒））可归因于脂肪族 CH 振动 [ 38 ]。整合噬菌体混合物的抗菌生物活性 EdiPhage 涂层中的这些条带不太明显，可能也是由于 CH-O 键的形成。噬菌体混合物的存在无关紧要，可能与用于生产 EdiPhage 涂层的百分比较低有关。
在对普通 EdiPhage 涂层和生物活性 EdiPhage 涂层进行表征时，还进行了热分析。两种 EdiPhage 聚合物涂层的 DSC 热分析图如图 8所示 。
图 8. 不含噬菌体颗粒的 EdiPhage 涂层（蓝线）和整合了噬菌体颗粒混合物的 EdiPhage 涂层（洋红色线）的差示扫描量热热分析图。
图 8 显示了 EdiPhage 涂层的热分析图。第一次吸热事件（样品和对照）可能与涂层脱水有关[ 41 ]。第一次吸热事件（76.67 °C/−35.79 J/g（样品）和 91.17 °C/−1.05 J/g 对照））可能与水合水分子从薄膜中的蒸发有关[ 41 ]。海藻酸钠中与脱水过程相关的吸热峰出现在 80 °C 左右[ 42 ]。第二次吸热事件（118.08 °C/−8.41 J/g（样品）和 117.70 °C/−150.11 J/g（对照））可能是由于解聚过程形成碳质残留物 [ 42 , 43 ] 。放热事件（252.37 °C/49.43 J/g（样品）和255.37 °C/80.91 J/g（对照））可能对应于裂解焓，例如复合物内键的断裂[ 44 ]。样品还显示出两个小的吸热事件，这可能是由于缓冲溶液（其中噬菌体被稀释）中的成分的影响，通过现有成分的静电相互作用增加了构象稳定性[ 45 ]。根据Helmiyati和Aprilliza的研究[ 39 ]，海藻酸盐的热分析测试表明，纯海藻酸钠的分解温度为251.12℃，非常接近所制备涂层（样品和对照）的降解温度，可以看出在放热事件中。从所给出的结果来看，可以说涂层对于预期应用来说是稳定的。
通过 X 射线透射断层扫描 (XRT) 获得的三维图像（图 9）可以观察到 EdiPhage 涂层的均匀性和同质性。一般来说，不存在原子密度较大或较小的区域（图 9），这对于食品级涂层来说是很有趣的。
图 9. 通过负载噬菌体颗粒的 EdiPhage 涂层的 X 射线透射进行断层扫描分析获得的图像：( a ) EdiPhage 样品的前视图和 ( b ) 同一 EdiPhage 样品的斜视图。使用设置为 31 kV 的工作电压和 661 μA 的电流收集三维图像切片。
通过扫描电子显微镜 (SEM) 获得的聚合抗菌 EdiPhage 涂层表面图像证实了其均匀特性（图 10）。
图 10. 聚合抗菌 EdiPhage 涂层表面在多个放大倍数下的显微照片（( a )：×50，( b )：×150，( c )：×700，( d )：×1700）。通过扫描电子显微镜（SEM）获得的图像证实了具有均匀特性的涂层的形成。
聚合的EdiPhage涂层的机械性能的评价结果显示在 图11中。一般来说，除了海藻酸盐本身的特性（分子量和 M/G 比（β-d-甘露糖醛酸（ M 嵌段）和 α-L-古洛糖醛酸）（G 嵌段））[ 46 , 47 ]。在分子水平上，Ca 2+ 离子的存在被认为是藻酸盐链旋转（运动）的障碍，降低了其移动性，从而降低了薄膜的伸长能力[ 48 ]。普通 EdiPhage 涂层和整合噬菌体颗粒混合物的抗菌 EdiPhage 涂层显示出彼此接近的钙含量。弹性越大的薄膜的拉伸强度越低，从而降低了完整性的维持能力[ 49 ]。由于多糖具有线性结构，基于多糖的可食用涂层和薄膜坚韧、高度可溶、无色且柔韧。基于海藻酸钠的可食用涂层通常具有良好的成膜性能，是最流行的可生物降解聚合物之一[ 50 , 51 ]。机械性能受到薄膜配方的强烈影响[ 52 ]。因此，根据添加的亲水胶体的百分比，范围可以很宽[ 53 ]。
图 11.所生产的抗菌 EdiPhage 涂层的 可压缩性和粘附性 ( a ) 以及硬度和内聚性 ( b ) 的结果，整合了裂解噬菌体颗粒的混合物。
获得的结果使我们能够确认该配方是否适合预期目的。配制的 EdiPhage 涂层的硬度约为。3.75 N，适合预期用途。较低的硬度使 EdiPhage 涂层不易碎，因此从产品表面过早脱落的可能性较低。由于抗菌 EdiPhage 涂层旨在包装成熟的奶酪，同时允许噬菌体颗粒的释放和移动，因此具有抗菌性能的涂层的粘附性较低，将对裂解噬菌体颗粒在奶酪中的可用性产生重大影响。预期的应用地点。鉴于涂层是通过聚合藻酸盐多糖形成的，抗菌 EdiPhage 涂层的可压缩性的较大值与配方的低于半固态状态一致。噬菌体颗粒在产品表面的释放至关重要，所产生的较差的内聚性（图11）与低粘附值是一致的。因此，硬度（不太高）、压缩性较高、粘附性差和内聚性低等结果都与抗菌 EdiPhage 涂层的预期用途一致。鉴于内聚性和粘附性是食品应用的关键品质，抗菌 EdiPhage 涂层粘附到成熟奶酪表面的能力（但程度不高）是一个极其重要的特性。生物多糖在聚合物链中建立键的能力，导致在受到机械压力时抵抗它们的分离，这是 EdiPhage 涂层的机械质量的主要原因 [ 54 , 55 ]。因此，评价机械阻力的标准是压缩性、硬度、粘合性和内聚性；抗牵引力、松弛性和弹性特性被认为与所生产的抗菌 EdiPhage 涂层无关。因此，根据此处给出的数据，抗菌 EdiPhage 涂层可以保持其物理完整性。